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二 抗

为分析二抗的使用情况,我们随机抽取了100篇2007年或2008年发表于Science 或 Journal of Biological Chemistry杂志上的 文章(英文),这些文章涵盖了来自于16个国家的约80个研究机构。收集的数据显示二抗的使用非常广泛,可以应用到几乎所有类型的免疫检测中,尤其是Western blot、免疫组织化学和免疫细胞化学。事实上,二抗在ELISA及流式细胞术中应用也很广泛,不仅用于科学研究,而且广泛的应用于临床分析和疾病诊断。比较而言,二抗在免疫沉淀中的应用相对较少。以下内容是基于对所收集的二抗信息进行统计分析后得出的一些结论,对于您在具体的实验中如何选择最适合的抗体具有借鉴作用。

选择二抗时,您必须考虑到以下因素,如一抗的物种、产生二抗的宿主、一抗的类别或亚类、二抗所耦联的探针类型及二抗的形式(如整个IgG分子,F (ab’) 2片段,或Fab片段)等等。因此选择哪种类型的二抗很大程度上决定于您所使用的一抗是什么,尤其针对种属和类别而言。

通常情况下,一抗可以在山羊、小鼠、兔子、大鼠及绵羊体内制备,其中属小鼠及兔子最为常见,相应的,二抗的种属也应当与一抗的相一致。而对于制备二抗的宿主,则应选择另外一种不同的动物,一般选用驴、山羊、兔子、绵羊或其他较大的动物,可以实现二抗的大规模制备,其中又属山羊使用最多。

对于二抗类别或亚类的选择,应遵循与一抗类别或亚类相一致的原则,其中抗IgG使用最多。这可能是因为除了五种类别的单克隆抗体外,很多一抗是多克隆抗体,属于IgG类免疫球蛋白。此外anti-IgG可以识别几乎所有类型?腎gG亚类,因此,在不清楚一抗是属于那个类别或亚类的时候,anti-IgG抗体是个不错的选择。从我们的数据来看,值得注意的是, IgG亚类特异性的二抗(如抗IgG1, 抗IgG2, 抗IgG2a, 抗IgG2b)通常用于双标记实验中,包括免疫细胞化学、免疫组织化学及流式细胞术。

此外,整个IgG分子是最常用的一种二抗分子形式,而F (ab’) 2片段或Fab片段一般仅用于特殊实验中,如需要避免抗体与具有Fc受体的细胞结合的情况,或需要封闭内源性免疫球蛋白的时候。

对于二抗所耦联的探针的选择,主要取决于具体的实验。对于Western blot,最常用的探针是辣根过氧化酶(HRP),碱性磷酸酶(AP)的使用也很多,但不如HRP使用广泛。此外,IRDye (如 IRDye 680、IRDye 800) and Alexa Fluor dye (如Alexa 680 ) 等系列染料也偶尔应用于 western blot当中。通过统计分析发现,来自于Amersham Biosciences、Bio-Rad、Cell Signaling、GE Healthcare Bio-Science、Jackson ImmunoResearch Laboratories、LI-COR Biotechnology、Pierce Biotechnology、Santa Cruz Biotechnology、Sigma 及 Zymed Laboratories公司的HRP标记的二抗在Western blot中均有广泛使用;而对于AP标记的二抗,您可以选择Jackson ImmunoResearch Laboratories、Sigma、Bio-Rad 及DAKO公司。

对于免疫荧光检测实验(包括免疫细胞化学及免疫组织化学),应用最广泛的是耦联有Alexa Fluor系列染料的抗体(如Alexa Fluor 488, 546, 568, 594, 596, 647, 633)、花青染料(Cyanine)系列标记的抗体(如Cy2, Cy3, and Cy5)、FITC及罗丹明(Rhodamine)。其中对于Alexa Fluor标记的二抗,推荐选择Invitrogen 公司或Molecular Probes公司(现属于Invitrogen公司),是著名的生产Alexa Fluor染料的公司。从我们收集的数据来看,Jackson Immunoresearch Laboratories公司的花青染料(Cyanine)系列标记的二抗使用较多,而对于FITC,Jackson Immunoresearch Laboratories、Santa Cruz Biotechnology、DAKO 及Sigma公司均可选择。Bio-Rad、Chemicon、Invitrogen或Sigma公司的罗丹明标记的二抗使用较好。另外,如果你想放大检测信号,你可以选择生物素标记的二抗,Jackson Immunoresearch Laboratories、Vector Laboratories 或R&D Systems均是不错的选择。

对于流式细胞术,FITC是选用最多的标签,PE标签也可以使用。

对于ELISA实验,HRP 和 AP标签使用最多。

在免疫沉淀中,二抗的使用并不是很多,但偶尔也有使用,如用于蛋白的分离,一般选择无耦联标记的二抗。

上一个:一 抗
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